На рубеже ХХI века сформировалось представление о микрофлоре организма человека как о еще одном органе, покрывающим в виде чулка кишечную стенку, другие слизистые оболочки и кожу человека. Оставаясь невидимым, этот «орган» весит около двух килограммов и насчитывает порядка 1014 клеток (сто миллиардов) клеток микроорганизмов. Это число в десять раз превышает число собственных клеток организма-хозяина, то есть — человеческих.

К представлению о единстве сообщества микроорганизмов, обитающих в нашем теле, привели первоначально исследования экологических и биотехнологических микробных сообществ. Оказалось, что микробы, во-первых, предпочитают жить, будучи прикрепленными к твердой поверхности, нежели свободно плавающими (как в водной среде рек и океана, в воздухе). Во-вторых, они организованы в так называемые биопленки, сбалансированные по видовому составу и функциональному распределению членов сообщества – как муравьи в муравейнике.

В биотехнологии стремятся специально подобрать оптимальное сообщество микроорганизмов для выполнения определенных функций. Это актуально в производстве пищевых продуктов, лекарств и пищевых добавок, утилизации разного рода отходов, нейтрализации загрязнений воды и почвы нефтепродуктами. Такие сообщества называют консорциумами микроорганизмов. Практика показала многократное увеличение эффективности работы микроорганизмов при такой организации. Консорциум, вообще-то, понятие биотехнологическое и предполагает сообщество микроорганизмов, специально созданное для осуществления определенной цели. В нем (сообществе) определены количественые и функциональные отношения. Они должны быть строго постоянны, иначе цель не достигается. В биотехнологии — это срыв производственного процесса (скажем, кефира или пива).

У человека такого допустить нельзя, его биореактор (кишечник) должен работать всю жизнь. Поэтому природа постаралась так организовать микробное сообщество, что оно сохраняется в течение всей жизни при максимальном колебании в концентрации отдельных микробов. Независимо от применения антибиотиков. Правильное их применение наряду с восстановительными мерами приводит к сохранению микрофлоры в прежних рамках.

По данным молекулярно-генетических исследований состав микрофлоры генетически связан внутри сообщества и специфичен на штаммовом уровне для индивидуума. Это очень прочная система. Туда нельзя внедрить чужеродный штамм. Нетрудно оценить ее гораздо большую антибиотикорезистентность in-vivo по сравнению с опытами в чашке Петри. Достаточно капли антибиотика в чашке, чтобы воспрепятствовать росту микроорганизмов в радиусе 42 мм (высокая чувствительность). В то же время кишечник остается заселенным при длительном применении антибиотиков широкого спектра действия.

Достойна удивления способность микробиоты кишечника сохранять стабильность в условиях разнородных химических и корпускулярных потоков, пронизывающих муцин вдоль и поперек. В соответствии с физиологическими канонами через кишечную стенку и вдоль нее ежесуточно проходит десять литров жидкости, включая слюну, желудочный сок с пищевым химусом, желчные и печеночные секреты и прочее. В противоположном всасыванию направлении движется муцин, который микробы кишечной стенки должны успевать переваривать на мономерные составляющие со скоростью его образования клетками слизистой оболочки.

Специальные исследования показали, что в биопленке по иному, в сравнении с чистыми культурами бактерий, происходят их многочисленные физиологические процессы, в том числе продукция метаболитов и биологически активных веществ. Сообщество организует единую генетическую систему в виде плазмид – кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые (трфические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром. Последнее получило специальное определение как социальное поведение (quorum sensing) микроорганизмов. Реакция микроорганизмов на изменение условий окружающей среды в биопленке существенно отличается от реакции каждого отдельного вида в монокультуре. Такая организация обеспечивает ее физиологическую и функциональную стабильность и, следовательно, является залогом конкурентного выживания в экологической нише. В организме человека специфическое преимущество такой организации заключается в обеспечении гомеостаза органов, функциональность которых зависит от населяющих их микробов.

Здоровый вид кожи, нормальное пищеварение, устойчивость к внешней инфекции (состояние иммунитета) человека во многом определяется стабильностью, можно сказать, «здоровьем» его микрофлоры.

Преимущество коллективного реагирования имеет и отрицательную сторону: таким сообществом трудно управлять извне. Например – лечить заболевания полимикробного происхождения, когда чувствительность к антибиотикам микроорганизмов, ассоциированных в биопленку, не соответствует таковой, определенной в лабораторных тестах на клинических изолятах чистых культур бактерий.

Коллективный иммунитет биопленки практически сводит на нет хорошую идею коррекцию дисбактериозов с помощью пробиотиков – препаратов живых культур ключевых микроорганизмов кишечника – бифидобактерий, лактобацилл, энтеробактерий и других. Несомненно, они создают эффект, но не всегда и не такой, как предполагалось по идее. Это происходит из-за коллективного иммунитета микробиоты (организованной микрофлоры) кишечника.

Микробы, выращенные искусственно, являются инородными, как инородны пересаживаемые человеку органы и ткани других людей – доноров, или животных. Они отторгаются вследствие биологической несовместимости. Биотехнологические пробиотики не имеют «пароля» для входа микробов внутрь биопленки кишечника, и поэтому пребывают в нем транзиторно, как микрофлора пищи. Это признают фирмы – производители пробиотиков и не утверждают, что их добавки восполняют физически дефицит соответствующих содержимому пробиотика микроорганизмов, но стимулируют рост ущемленной популяции.

Отсутствие приживаемости чужеродных микробов подобного вида есть косвенное доказательство существования микрофлоры человека как самостоятельного органа. Появился термин «парацитология биопленки», как структуры, похожей на ткань высших организмов что подразумевает выполнение в ней законов, ей присущих.

Существует еще множество обстоятельств, в силу которых микробиоту человека следует рассматривать как индивидуально специфичную, генетически детерминированную и, видимо, – наследуемую. Б.А.Шендеровым была предложена (в виде авторского свидетельства, полученного в начале девяностых годов прошлого века) идея консервации индивидуальной микрофлоры в молодом здоровом периоде жизни конкретного человека с целью допирования ее в будущем при серьезных нарушениях кишечного биоза с целью его оздоровления, даже можно сказать — омоложения.

Гастроэнтерологам же известны случаи «пересадки» микрофлоры больному от родственника «пер клизмум» с положительным эффектом коррекции дисбактериоза кишечника.

Современные представления о составе микробиоты кишечника по данным молекулярных исследований

B2360121-Yoghurt_bacteria-SPL

Сведения о природе микробиоценоза кишечника, накопленные к настоящему времени, выглядят достаточными для понимания его функционирования, как физиологически активного органа человека. Однако на данный момент не достает количественного метода определения изменений в составе достаточно широкого круга ключевых микроорганизмов.

Причем желательно анализировать состав пристеночной кишечной микробиоты, а не микрофлоры фекалий, как это принято повсеместно.

Именно в мукозном слое, облегающем слизистую оболочку кишечника происходит усвоение пищевого химуса, поступающего из желудка, усвоение необходимых питательных веществ клетками эпителия кишечной стенки и дополнительная продукция микроорганизмами большого числа биологически активных веществ: ферментов, витаминов, антибиотиков, иммуностимуляторов, а также токсинов и метаболитов, вредных для человека.

Предполагается, что отсутствие баланса в их продукции связано с патологическими проявлениями самого разного характера: кишечные расстройства, кожные заболевания, половые дисфункции и сердечная недостаточность. Микрофлора фекалий является отходом этих процессов, в котором продолжается продукция микроорганизмов, но уже в иных условиях по сравнению с верхними отделами кишечника. По мнению известного специалиста в области клинической микробиологии проф. А.Н.Маянского она отражает скорее полостную (свободноживущую, или планктонную), чем пристеночную биопленку, которая более стабильна и физиологична. Цитируя Маянского в части определения дисбактериоза кишечника по фекалиям нельзя не согласиться, что «фактически это дорогостоящее (тем более, что тестирование рекомендуется делать в динамике), трудоемкое исследование с невысокой (если не с нулевой) отдачей».

Подходящий для решения такой задачи метод появился в России в начале 90-х прошлого уже века. Он был разработан на базе исследований НИИ биологического приборостроения при поддержке академика РАН Г.А.Заварзина и гранта Министерства экологии и охраны недр РФ «Экологическая безопасность России».

Метод основан на выявлении присутствия микроорганизмов в объектах окружающей среды (воде, почве, стоках и т.п.) по специфическим для них химическим веществам – маркерам из числа жирных кислот, альдегидов и стеринов, входящих в состав их клеточной стенки.

Специфичность означает, что подобные вещества содержатся только в липидах микроорганизмов и не содержатся в среде их обитания. Поэтому, имея достаточно чувствительный метод анализа их можно обнаружить и измерить количественно непосредственно в среде обитания, избежав необходимости предварительно культивировать их на искусственных средах. Это оказалось возможным сделать с помощью метода газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (сокращенно – ГХ-МС). Его результатом является определение состава микробных маркеров с точностью 2% относительных. Вместе с подготовкой проб и расчетом состава микробного сообщества по отдельной программе стандартная процедура контроля 170 микроорганизмов в пробе занимает около 5 часов (!!!).

Метод детектирования микроорганизмов по ЖК-маркерам сродни генетическому (ПЦР, определение последовательности нуклеотидов 16sРНК и пр.), поскольку состав жирных кислот детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего синтеза ЖК в митохондриях по матричным РНК. Поэтому профиль ЖК бактерий является их визитной карточкой или фингерпринтом как отпечатки пальцев людей. Он так же консервативен, как строение ДНК, но и так же подвержен мутациям под действием факторов окружающей среды.

По современным представлениям, населяющие кишечник микроорганизмы являются основными переработчиками потребляемой человеком пищи в молекулярную форму. Только в таком виде она может быть доставлена посредством всасывания на кишечной стенке в кровь и далее в клетки тела. Кроме того, микробы синтезируют в своих клетках множество необходимых человеку веществ – витаминов, ферментов, незаменимых аминокислот и других. От стабильности этого процесса и зависит здоровье, следовательно — тонус и качество жизни человека.

Как отмечалось, для контроля и управления микробиотой кишечника необходим количественный метод анализа ее состава, и он получен в виде опосредованного определения ее состава по данным масс-спектрометрии жирных кислот. При использовании этого метода накоплена информация по пристеночной микрофлоре тощей, подвздошной и ободочной кишок путем ГХ-МС анализа микробных маркеров в биоптатах, получаемых в отделениии патологии тонкого кишечника ЦНИИГ, возглавляемом профессором Пафеновым А.И., при исследованиях здоровых добровольцев и больных с синдромом раздраженного кишечника и антибиотико-ассоциированной диареей. Эти исследования впервые позволили установить характер распределения микроорганизмов по отделам кишечника. Их сопоставление с анализом фекалий у тех же пациентов показали, что адекватно динамике заболевания и лечения пробиотиками меняется только пристеночная микробиота. Микрофлора фекалий каких-либо корреляций с процессом не обнаруживает.

При современных методах анализа микрофлоры и предполагаемого доминирования бифидобактерий создает рутинная практика анализа только бифидобактерий и условно-патогенной микрофлоры при исследованиях дисбактериозов. При этом из поля зрения микробиолога выпадают эубактерии, бактероиды и клостридии, которых в фекалиях по современным оценкам по крайней мере в несколько раз больше, чем бифидобактерий.

Применение масс-спектрометрического метода дало возможность измерить численность более 50 таксонов микроорганизмов кишечника не только в фекалиях, но и в отделах самого кишечника, путем анализа их маркеров (жирных кислот) непосредственно в биоптатах. В результате исследований был сделан вывод:

Кишечная микробиота представляет собой доминирующий континуум штаммов и видов родов Clostridium и Eubacterium при равновеликом суммарном количестве бактероидов, бифидобактерий и лактобацилл.

Следует отметить принципиально важную особенность представителей рода Eubacterium, заключающуюся в способности образовывать водород. Это ключевое свойство консорциумов микроорганизмов, осуществляющих дайджест органического субстрата при анаэробных процессах в природе (болота), в рубце жвачных и в биотехнологии при анаэробном сбраживании разного рода отходов и получении биогаза. Мукозный слой кишечника человека по существу является аналогичным биореактором. Там идет образование метана, следовательно, работают бактерии-метаногены, эффективность которых строго зависима от концентрации водорода в системе. В метаногенном сообществе водородные бактерии играют ключевую регуляторную роль еще и благодаря обратной связи процесса продукции и потребления водорода на первичный процесс расщепления углеводов с образованием ацетата. Изменение численность эубактерий, что должно приводит к увеличению концентрации водорода в системе. Так экспериментально показано четырехкратное увеличение концентрации водорода в выдыхаемом воздухе у больных с синдромом раздраженного кишечника и его возвращение в норму при снятии симптомов в результате ограничительной диеты.

Основную долю (от 70% в тощей кишке до 90 в фекалиях) микроорганизмов во всех отделах кишечника составляют анаэробы. Второе место по численности в тощей кишке занимают аэробные актиномицеты – 17% (в фекалиях их всего 0,7 %).

Аэробные кокки (стафилококки, стрептококки, энтерококки) и коринеформные бактерии составляют 5% колонизации тонкого кишечника по сравнению с 0,7 % в фекалиях. Доля энтеробактерий и энтерококков по отделам кишечника и в фекалиях близка к 2%.

Неожиданным результатом, несомненно, является обнаружение значительного количества аэробных актиномицетов.

nevidimiyorgan1

Колония аэробного актиномицета Nocardiopsis dassonvilley, выделенного из пристеночного слоя тонкого кишечника.

Высокая степень колонизации кишечника актиномицетами не выглядит необычным явлением, если иметь в виду, что они широко распространены в окружающей среде – почве, воде, воздухе, на внутренних стенах жилых и производственных помещений. Их обитание в организме человека при таких обстоятельствах выглядит естественным.

Действительно, в руководствах по клинической микробиологии отмечается обнаружение актиномицетов и родственных организмов, таких как Mycobacterium, Actinomadura, Propionibacterium, Actinomyces,Corynebacterium, Bifidobacterium в кишечнике и других органах человека. Там они фигурируют (в том числе и бифидобактерии) как участники инфекционных и воспалительных процессов (Mannual on Clinical Microbiology). Однако патогенность актиномицетов, чувствительность к антибиотикам, способы лечения связанных с ними заболеваний являются предметом единичных специализированных лабораторий и клиник в мире.

Трудности в их бактериальной диагностике и культивировании послужили препятствием широкой известности этих микроорганизмов в клинической практике. В том числе при многочисленных заболеваниях, связанных с изменением микробиоты кишечника и кожи.

nevidimiyorgan2

Обильный рост на чашке Петри бактерий из биоптата стенки тонкого кишечника свидетельствует о многочисленности и многообразии микробного сообщества.

nevidimiyorgan3

Микроскопический гриб из пристеночного слоя тонкого кишечника.

Существенный вывод для практики диагностики и мониторинга пристеночной микробиоты кишечника дало одновременное определение концентрации микробных маркеров в крови тех же пациентов. Оказалось, что их концентрация коррелирует с концентрацией микробов на кишечной стенке, измеренной в биоптатах. Это физиологически закономерно, так как при естественной гибели микробных клеток их липиды разбираются ферментной системой кишечника, при этом не использованные на его стенке жирные кислоты микроорганизмов поступают в кроветок.

Это явление дает возможность контролировать состояние микробиоты кишечника по данным анализа микробных жирных кислот в капле крови (40 мкл) из пальца.

Следует лишь учесть, что в кровь попадают также микробные молекулы от микроорганизмов, обитающих на других слизистых оболочках человека (ротоглотка, урогенитальный тракт), а также из очагов воспаления, вызванных собственной микрофлорой или возбудилем, поступившим извне.

Наличие маркеров микроорганизмов такого происхождения в крови теоретически обусловлено механизмом иммунного ответа на появление возбудителя. Фагоцитирующие клетки организма человека адсорбируют и переваривают антигены микроорганизмов, в том числе и целые клетки, и выводят продукты лизиса в поток лимфатической и кровеносной систем. Кроме фагоцитоза, клетки микроорганизмов разрушаются под действием других механизмов, в том числе собственного апоптоза и лизиса ферментами белкового комплемента крови и других компонентов иммунной защиты. В любом случае разрушение происходит, в конечном счете, до мономерных составляющих биополимеров. Исходя из основ физиологии обмена биологических жидкостей человека, обмен 70% жидкости плазмы с межклеточным пространством происходит за 1 мин. Поэтому малые фрагменты микробных биополимеров, образующиеся в этом пространстве, поступают в кровь практически сразу. То есть наличие микробных маркеров в крови отражает состав микробных сообществ тела человека, независимо от места обитания микроорганизмов или очага воспаления.

Иначе говоря, измеряя концентрацию микробных маркеров в крови можно оценивать микроэкологический статус человека в целом

Существенное изменение состава микробных маркеров в крови по сравнению со статистически обоснованной нормой обнаружено при перитоните, воспалениях урогенитальных органов и при кожных заболеваниях — атопическом дерматите, себорейном дерматите, экземах, псориазе, эндокардите, перикардите и лихорадках неизвестной этиологии.

Георгий Осипов,

Доктор биологических наук

О том, как поддерживать нормальную микрофлору, влияние нарушений микрофлоры на развитие таких заболеваний как вагинозах, простатите и мужском бесплодии, алопеции (облысении), атопическом дерматите, себорее, акне (угревой сыпи) в следующих статьях.

Источник